Pcambia-vektor-biner-pilihan

Pcambia-vektor-biner-pilihan

Jforex submitorder kebangkrutan
Pikirkan platform forex mt4
Forex-trading-best-indicator-untuk-intraday


Opsi-strategi sederhana-untuk-60-detik-biner Analisis volume perdagangan-forex Forex-trading-reviews-newspaper Long-candle-forex-trading-course-pdf (2) Debitur bangsa investopedia forex Forex-trading-secrets-a-trading-system-disclosure-pdf-file

Vektor pCambia Informasi tentang vektor terbaru kami, yang berisi GUSPlustrade, dapat ditemukan di BioForge. Sementara Cambia tidak lagi mendistribusikan vektor-vektor ini, Anda tetap dapat meminta mereka dari lab lain yang menggunakan atau menerbitkannya (mereka tersedia di bawah persyaratan open source dari lisensi BiOS (info)) Sebagian besar informasi di bawah ini berkaitan dengan pCAMBIA yang lebih tua. Vektor Transformasi tanaman sekarang rutin dilakukan di ratusan laboratorium di seluruh dunia, menggunakan metode transfer DNA yang dimediasi secara bakteri atau langsung seperti pemboman. Metode ini memiliki keterbatasan teknis dan intelektual (lihat Proyek BioForge TransBacter, yang meningkatkan alternatif transformasi Agrobacterium agar lebih bebas beroperasi). Salah satu keterbatasan teknis terbesar yang dihadapi laboratorium adalah banyak vektor yang masih digunakan adalah peninggalan sejarah dengan fitur standar yang membuat konstruksi DNA canggung atau tidak praktis: asal usul tiruan yang rendah karena menghasilkan DNA hasil yang rendah membuat replika yang tidak stabil, menyebabkan hilangnya variabel plasmid selama Propagasi ukuran besar tidak memiliki situs pembatasan yang mudah digunakan untuk manipulasi pilihan terbatas penanda yang dapat dipilih untuk bakteri dan tanaman yang tidak memiliki cara sederhana untuk membangun fusi gen reporter Batang punggung vektor pCAMBIA berasal dari vektor pPZP (dibangun oleh Hajdukiewicz, Svab amp Maliga, lihat Referensi ). Meskipun tidak sempurna dan memiliki keterbatasan teknis dan IP (lihat Proyek BioForge GUSPlus, di mana memperbaiki gen reporter dan metode seleksi untuk kebebasan yang lebih lengkap untuk beroperasi), vektor pCAMBIA menawarkan: nomor salinan tinggi dalam E.coli untuk menghasilkan DNA pVS1 yang tinggi. Untuk stabilitas tinggi dalam ukuran kecil Agrobacterium, 7-12kb tergantung pada lokasi restriksi plasmid yang dirancang untuk modifikasi plasmid modular dan poliester link kecil namun cukup untuk memasukkan DNA pilihan bakteri yang Anda inginkan dengan pemilihan tanaman kloramfenikol atau kanamisin dengan higromisin B atau kanamisin (phosphinothricin Seleksi dihentikan atas permintaan pemilik IP, Bayer, setelah distribusi awal pada tahun 1997) sarana sederhana untuk membangun fusi translasi menjadi gen reporter gusA. Beberapa poin tentang strategi kloning pCAMBIA: Polylinker pUC18 digunakan pada beberapa vektor, tapi pUC8 dan pUC9 juga digunakan untuk menyederhanakan pilihan enzim kloning. Di usia PCR, tidak perlu lagi memiliki sejumlah besar situs kloning. Polylinker yang lebih kecil juga menghilangkan potensi konflik dari situs seperti Sph I (yang memiliki ATG) atau Xba I (yang memiliki TAG). Hal ini membuat situs lain dalam vektor lebih bermanfaat (seperti situs Sph I di luar Perbatasan T-DNA kanan, atau situs Sac II di luar Perbatasan T-DNA kiri). Gen seleksi tanaman pada vektor pCAMBIA didorong oleh versi promoter CaMV35S penambah ganda dan diakhiri dengan sinyal poli CaMV35S. Perhatikan bahwa promotor 35S ini dapat memiliki efek penambah pada ekspresi gen lain dalam kaset yang sama, sehingga hasil ekspresi gen menggunakan derivatif pCAMBIA dimana bagian promotor ini masih ada harus ditafsirkan dengan hati-hati. Selanjutnya, Anda bertanggung jawab untuk memeriksa apakah promotor 35S atau komponen lain yang Anda gunakan tunduk pada paten di negara Anda. Anda dapat menemukan bantuan dengan ini di website CAMBIAs Patent Lens. Gen reporter menampilkan tag heksa-Histidin di ujung-C untuk memungkinkan pemurnian sederhana pada resin kromatografi afinitas logam yang tidak bergerak. Urutan untuk tag ini terjadi antara situs Nhe I pertama (ada situs Nhe I kedua di rep pVS1 yang tidak kami hilangkan) dan situs PML I yang unik. Gen yang menarik dapat dimasukkan sebagai pengganti gen reporter. Penyisipan tanpa kodon berhenti dan dalam bingkai di situs (pertama) Nhe I akan menambahkan tag heksa-Histidin untuk protein yang Anda minati. Penyisipan tanpa kodon berhenti dan dalam bingkai di situs Pml I akan menambahkan kodon berhenti. Penyisipan di situs Bst EII tidak akan menambahkan tag atau kodon berhenti (jadi Anda mungkin ingin memastikan bahwa urutan yang disisipkan di sini mengandung kodon berhenti). Nomenklatur vektor pCAMBIA: Sistem penomoran empat digit bekerja sebagai berikut: Angka pertama - menunjukkan pemilihan tanaman: 0 untuk ketidakhadiran 1 untuk resistansi higromisin 2 untuk kanamisin dan 3 untuk phosphinothricin (vektor yang mengandung gen reseptor phosphinothricin tidak lagi tersedia dari CAMBIA di Permintaan Bayer, yang memiliki hak paten yang membatasi penggunaannya di beberapa negara). Angka kedua - menunjukkan pilihan bakteri: 1 untuk resistensi spektinomisinstreptomisin 2 untuk kloramfenikol 3 untuk kanamisin 4 untuk specstrep dan kanamisin. Angka ketiga - menunjukkan polylinker yang digunakan: 0 untuk pUC18 polylinker 8 untuk polylinker pUC8 9 untuk polylinker pUC9. Angka ke empat - menunjukkan gen reporter yang hadir: 0 untuk tidak ada gen reporter 1 untuk E.coli gusA 2 untuk mgfp 5 3 untuk gusA: mgfp 5 fusi 4 untuk mgfp5: gusA fusi 5 untuk Staphylococcus sp. GusA (GUSPlus). Angka kelima - catat beberapa fitur khusus lainnya. Sejauh ini hanya digunakan dengan: pCAMBIA1305.1 dan plasmid yang berasal darinya, dimana .1 menunjukkan tidak adanya peptida sinyal dari protein GUSPlustrade dan pCAMBIA1305.2 dimana 0,2 menunjukkan adanya peptida sinyal GRP untuk Dalam sekresi planta protein GUSPlustrade. Lagging letter - X menunjukkan bahwa gen reporter tidak memiliki kodon start sendiri dan vektornya adalah untuk menciptakan fusi ke reporter Z menunjukkan adanya lacZa fungsional untuk penyaringan warna biru putih abc menunjukkan bingkai bacaan untuk fusi dengan vektor Fuse and Use. Catatan penting . Karena keterbatasan sumber daya, tidak semua kombinasi fitur vektor yang mungkin telah dibuat di CAMBIA. Awalnya Anda mungkin kecewa karena kami tidak memiliki, misalnya, pCAMBIA2205.2. Namun, vektor dirancang sedemikian rupa sehingga seharusnya menjadi masalah yang relatif sederhana bagi peneliti yang membutuhkan vektor semacam itu untuk membangunnya dari komponen pada vektor lain. Jika Anda telah membuat turunan vektor pCAMBIA yang peneliti lain akan berguna dan Anda ingin berbagi dengan peneliti lain, kirimkan email kepada kami. Addendum Manual Vektor: Catatan penting untuk pengguna pCAMBIA Vektor ini adalah bagian dari seri baru vektor pCAMBIA GT-BACK (Kompetensi Akuisisi Transfer Transfer Bakteri dengan seleksi kanamisin) yang mencakup versi modifikasi dari pCAMBIA 1105.1 dan fragmen plasmid Ti (Berasal dari pTiBo542) yang hanya mengandung virA, virB, virC, virD, virE, virG, virK amp virJ operons. Varian kesatuan baru ini memungkinkan kemampuan transfer DNA dipindahkan ke, dan distabilkan, kisaran bakteri yang jauh lebih luas dan akan disediakan sebagai toolkit open source. Fitur nilai tambah dari vektor baru atas Teknologi Transbakter adalah: banteng Hal ini dapat didistribusikan sebagai titik DNA encer di atas kertas (misalnya pada sebuah surat) yang menghilangkan kebutuhan untuk mematuhi kontrol impor pada organisme hidup, dan masalah karantina lainnya. Ini adalah sarana yang digunakan oleh ribuan laboratorium di seluruh dunia untuk mendapatkan (dan selanjutnya mengirimkan) pose vektor pCAMBIA. Bull GT-BacK vector tidak memiliki oriT yang diturunkan RK2 yang dibawa Transbacter, sehingga menghilangkan atau mengurangi kemampuan plasmid untuk dikonjugasikan dan ditransmisikan ke host lain oleh fungsi konjugasi RK. Bull Ini memiliki replikasi rentang host yang luas dari pVS1 yang memungkinkan spektrum bakteri lebih luas untuk dieksplorasi sebagai vektor transfer gen, yang memungkinkan pilihan simbion jinak yang tidak memaksakan tekanan fisik atau genetik pada tanaman. Jika Anda ingin mendiskusikan atau menanyakan materi CAMBIA, silahkan masuk ke pCAMBIA0380 pCAMBIA0390. Rangkuman ini berisi serangkaian situs restriksi di kedua sisi pyl8 (0380) atau pUC9 (0390) polylinker, yang membuatnya sesuai untuk tujuan konstruksi lanjutan dengan sisipan pengguna. Promotor mereka sendiri, gen seleksi, gen reporter, dan lain-lain. Sinyal fungsional hanya antara batas T-DNA adalah kode awal dan kodon, tag histidin, dan sinyal NOS-poli (A). Semua fitur standar tulang punggung pCAMBIA hadir: pemilihan bakteri kanamisin, jumlah fotokopi tinggi di E. coli. Dan replikasi stabil di A. tumefaciens. PCAMBIA1200 pCAMBIA1300 pCAMBIA1380 pCAMBIA1390 pCAMBIA2200 pCAMBIA2300 Periset yang menginginkan versi terbaru harus melihat pCAMBIA 1305.1, pCAMBIA1105.1 atau pCAMBIA 1305.2. Yang bisa diminta melalui Proyek BioForge GUSPlus. Informasi tentang vektor pCAMBIA yang lebih tua ada di sini untuk kenyamanan. Vektor ini mengandung urutan heterolog minimal untuk transformasi tanaman dan pemilihan transforman sehingga memungkinkan penyisipan gen yang diinginkan untuk transformasi menjadi tanaman namun memerlukan semua urutan promoter dan terminator untuk ekspresi tanaman gen yang baru dikloning. Varian seleksi minimal memiliki satu dari dua gen seleksi tanaman: hpt II mengkodekan ketahanan terhadap hygromycin, atau npt II yang mengkodekan resistansi terhadap kanamisin. Dalam kedua kasus, gen seleksi didorong oleh versi promoter promoter CaMV35S ganda. Gen ini telah mengalami mutagenesis yang diarahkan ke situs untuk menghilangkan situs pembatasan yang mengganggu dalam urutan pengkodean dengan perubahan diam. Dua penanda resistensi bakteri yang berbeda disediakan (kanamisin atau kloramfenikol), yang memungkinkan strain Agrobacterium atau E. coli luas digunakan. Polylinker pUC18 dalam fragmen acZa l memungkinkan penyaringan klitoris bluewhite dalam pekerjaan kloning E. coli. PCAMBIA1380 dan 1390 didasarkan pada pCAMBIA1300, namun fragmen polylinker-lacZa pUC18 telah dihapus dan diganti dengan pylester pUC8 (1380) dan pUC9 (1390) sederhana, yang tidak mengandung permodelan start atau stop codon yang berpotensi membingungkan. Format modular lengkap disediakan untuk kloning PCR yang mudah digunakan dan ekspresi gen. Bagi peneliti yang melakukan analisis promotor penggunaan vektor minimal yang mengandung GUSPlus (pCAMBIA 0305.2 yang dapat dipesan melalui Proyek BioForge GUSPlus) direkomendasikan, bukan vektor pCAMBIA lainnya. Strategi transformasi bersama diinginkan untuk secara fisik terpisah dalam genom tanaman yang ditransmisikan sebagai promotor gen seleksi tanaman (biasanya 35S) dan promotor yang diminati (seringkali jauh lebih lemah atau lebih spesifik) yang mendorong gen gus atau gen reporter lainnya. Cara yang telah kita lakukan selama bertahun-tahun ini adalah bahwa dua vektor secara terpisah ditransformasikan menjadi strain Agrobacterium yang sama (atau lebih baik lagi strain dari BioForge TransBacter Project untuk kebebasan beroperasi), namun jelaslah bahwa transformasi bersama juga dapat dilakukan oleh Secara simultan mengubah dengan dua isolat terpisah masing-masing berisi salah satu vektor. Jika menggunakan satu isolat, koloni tunggal dipilih, DNA plasmid dianalisis, sel-sel diinduksi pada media khusus (jika diperlukan untuk spesies tanaman Anda), dan kedua garis sel dicampur bersama segera sebelum aplikasi ke jaringan tanaman berubah. Di tangan kita, metode ini memberi 10-30 dari garis tanaman yang ditransformasikan yang mengandung kedua T-DNA. PCAMBIA1201 pCAMBIA1301 pCAMBIA2201 pCAMBIA2301 Periset yang menginginkan versi terbaru harus melihat pCAMBIA 1305.1, pCAMBIA1105.1 atau pCAMBIA 1305.2. Yang bisa diminta melalui Proyek BioForge GUSPlus. Informasi tentang vektor pCAMBIA yang lebih tua ada di sini untuk kenyamanan. Vektor ini mengandung gus berfungsi penuh Seorang wartawan membangun analisis analisis gen dan keberadaan gen yang sederhana dan sensitif di tanaman regenerasi dengan uji GUS. Konstruksinya menggunakan E. coli gusA (N358Q mdash untuk menghindari glikosilasi terkait-N) dengan intron (dari gen kombo kastor kastor) di dalam urutan pengkodean untuk memastikan bahwa ekspresi aktivitas glucuronidase berasal dari sel eukariotik, bukan dari ekspresi oleh residual. Sel A.tumefaciens. Gen reporter gusA dikloning dalam format modular baru. Plasmid ini cocok untuk memasukkan gen lain yang mengandung promotor dan terminatornya sendiri. Periset dapat mengecualikan gen gusA dan memasukkan gen mereka sendiri yang diminati di tempatnya atau menggunakan vektor ini untuk menciptakan fusi gusA dengan gen yang mereka minati (jika Anda telah membuat turunan vektor pCAMBIA yang menurut peneliti lain bermanfaat dan ingin dibagikan Itu, tolong beritahu kami). Vektor-vektor ini mengandung polylinker-lacZa pUC18 dan gen seleksi tanaman dan bakteri yang sama dengan Vektor Seleksi Minimal yang sesuai. PCAMBIA1302 pCAMBIA1303 pCAMBIA1304 Bagi mereka yang menginginkan yang terbaik dari kedua dunia dalam gen reporter, kami membangun vektor-vektor ini, serupa dengan utilitas pada GUS Intron Selection Vectors (GIS), namun termasuk GFP. Menjadi protein non-katalitik menempatkan batas intrinsik pada sensitivitas deteksi dengan protein neon dan peralatan mahal diperlukan untuk pengujian kuantitatif dan pengamatan mikroskopik. GFP tetap populer sebagai gen reporter dan kami menyediakannya dalam format Modular Baru lengkap untuk mereka yang ingin menggunakannya. Vektor ini didasarkan pada pCAMBIA1301 (resistensi bakteri kanamisin, seleksi higromisin tanaman, polylinker pUC18 di lacZa) namun mengandung versi 5 mg protein fluoresen hijau Aequoria victoria (Siemering et al 1996.) - sendiri - pCAMBIA1302 - atau dalam fusi translasi Dengan gusA (N358Q) dalam kedua pengaturan: pCAMBIA1303 memiliki fusi gusA-mgfp5 -His6, dan pCAMBIA1304 memiliki fusi A-Hisig mgfp5 gus. Ini adalah versi intrusless dari gusA (N358Q), jadi ada kemungkinan bahwa ekspresi pada transforman primer adalah hasil dari ekspresi protein reporter oleh sel Agrobacterium tumefaciens residual atau bakteri lain yang ada pada budaya tanaman. Analisis sejumlah besar transforman beras dan Arabidopsis di CAMBIA menunjukkan bahwa fluoresensi yang dihasilkan oleh protein MGFP5 cukup samar. Sebagai hasil dari penelitian ini, periset kami membangun konstruksi serupa dengan menggunakan gen egfp yang tersedia dari Clontech. Hasil dengan protein ini jauh lebih unggul dan, walaupun kita tidak dapat mendistribusikan vektor yang mengandung gen ini, kami merekomendasikan agar para peneliti membeli pEGFP dari Clontech dan menggunakannya untuk membangun plasmid mereka sendiri yang serupa dengan pCAMBIA1302, pCAMBIA1303 atau pCAMBIA1304. PCAMBIA1381 dan 1391 dan Xa mereka, b, c varian ORF Dirancang untuk memanfaatkan gus A sebagai reporter ekspresi gen yang benar dengan konstruksi fusi, vektor-vektor ini berasal dari pCAMBIA1380 dan 1390, dan mengandung promoterless, non intron gus A (N358Q) Gen (tanpa kodon inisiasi) dalam tiga bingkai bacaan, dan dengan pyl8 atau pUC9 yang berorientasi pada polylinker. Hal ini memungkinkan pembuatan fusi protein karboksi-ujung sederhana menjadi gus. Pemilihan tanaman adalah dengan hygromycin, dan seleksi bakteri dengan kanamisin. Vektor pCAMBIA1381 dan 1391 juga dapat digunakan untuk konstruksi fusi transkripsi atau translasi menjadi gus A. Mereka mirip dengan seri Xa, b, c meskipun mereka mempertahankan kodon inisiasi dari situs Nco I dalam struktur Modular Baru di sekitar gus A (N358Q) gen, dan hanya tersedia dalam satu bingkai bacaan. PCAMBIA1281Z pCAMBIA1291Z pCAMBIA1381Z pCAMBIA1391Z Dirancang untuk pengujian promoter di planta. Vektor-vektor ini menampilkan versi promoterless dari gus A (N358Q) dengan intron katalase segera di hilir lacZa yang dipotong yang mengandung polylinker pUC8 atau pUC9. Semua plasmid dalam rangkaian ini memiliki higromisin sebagai gen seleksi tanaman, dan pilihan bakteri tersedia dengan kloramfenikol (1281Z, 1291Z) atau kanamisin (1381Z, 1391Z). LacZa yang dipotong berfungsi untuk pemutaran bluewhite pada klon dalam strain inang E.coli yang sesuai. Pengalaman dengan vektor-vektor ini telah menunjukkan bahwa promotor 35S yang sangat kuat (sebenarnya merupakan versi peningkat ganda) yang mendorong gen hptII di T-DNA dari pCAMBIA ini dan sebagian besar masalah lainnya menyebabkan gangguan yang signifikan pada pola ekspresi yang diamati. Interpretasikan hasil Anda dengan hati-hati Transformator kontrol negatif yang dibuat dengan menggunakan salah satu vektor ini tanpa promotor yang menambahkan hulu gen gusA menunjukkan ekspresi GUS tingkat rendah ke dalam kisaran jaringan. Eksperimen perangkap penambah yang dilakukan di CAMBIA menggunakan versi yang agak disusun ulang dari vektor-vektor ini juga menunjukkan ekspresi campur tangan yang konsisten yang kami kaitkan dengan promotor 35S terdekat. Ekspresi artefak ini mungkin diperburuk dalam eksperimen di mana para periset mencoba menganalisis versi trimmed-down promotor minat mereka yang tidak memiliki rangkaian penguat alami promotor panjang penuh. Untuk menghindari interferensi 35S ini dari analisis promotor, kami merekomendasikan untuk menggunakan strategi transformasi bersama seperti yang dijelaskan di atas pada bagian pada Vektor Seleksi Minimal. Dalam strategi seperti itu, promotor minat dapat dikloning ke dalam salah satu Promotor Cloner Vectors kami, namun ini pertama-tama harus dimodifikasi dengan melakukan pencernaan ganda Sma I amp Xmn I, pemurnian gel dari fragmen tulang belakang (8.9kb) yang besar, dan self Pemborosan Vektor semacam itu bisa disebut pCAMBIA0381Z, namun kita tidak pernah membangunnya untuk distribusi sebagai bagian dari kit vektor pCAMBIA. Genotipe strain Agrobacterium tumefaciens yang berguna Peringatan. Penggunaan Agrobacterium dibatasi di yurisdiksi seperti Amerika Serikat, dan mungkin tidak bijaksana menggunakannya dalam penelitian apa pun yang mungkin menghasilkan produk untuk dijual atau diimpor ke Amerika Serikat. Anda mungkin ingin menggunakan sistem Transbakter sebagai gantinya agar kebebasan beroperasi. Sebagai informasi, lihat Proyek BioForge TransBacter. LBA4404 (Ach5 pTiAch5) SmSp (R) pada plasmid virulensi (dari Tn904) semua T-DNA pTiAch5 dihilangkan pada pAL4404 (Hoekema dkk, 1983). EHA101, genotipe C58 pTiBo542 T-region :: aph, Km (R) A281 derivatif yang menyimpan pEHA101, T-DNA diganti dengan nptII, penghapusan batas-batas T-DNA yang tidak diketahui, sangat virulen (Hood et al 1986). EHA105 adalah derivatif Km (S) dari EHA101 (Hood et al., 1993). AGL1, genotip adalah AGL0 (C58 pTiBo542) recA :: bla, T-daerah yang dihapus Mop () Cb (R) AGL0 adalah EHA101 dengan daerah T yang dihapus, yang juga akan menghapus gen aph (Lazo et al 1991). A281, strain yang direkonstruksi, turunan dari A136 (C58 yang disembuhkan) yang menyimpan pTiBo542, sangat virulen (Hood et al., 1986). Ach5. Agrokinopin, tipe oktomat tipe B6S3, A6. Tipe gurita tipe Bo542 Leucinopin, suksinamopin, tipe agropin, lebih lemah dari A281 C58, T37. Tipe nopaline A281. Suksinamopin, leucinopin, agrokinopin Antibiotik Kloramfenikol, 100 mikrogmL untuk strain AGL1, 10 mikrogmL untuk LBA4404, 25 mikrogmL untuk EHA105 dan untuk E. coli. Kanamisin, 50 mikrogmL untuk kedua Agrobacterium dan E. coli. Untuk pemilihan tanaman padi yang ditransformasikan kita menggunakan hygromycin pada suhu 50 mikrogmL dan 25 microgmL untuk tembakau. Chen L, Zhang S, Beachy RN, Fauquet CM (1998) Sebuah protokol untuk produksi padi transgenik skala besar yang konsisten dan berskala besar. Laporan Tanaman Sel 18: 25-31 Christou P (1991) Produksi tanaman transgenik (Oryza sativa L.) dari varietas indica dan japonica yang penting secara agronomi melalui percepatan percepatan partikel DNA eksogen ke embrio zigotik yang belum menghasilkan. Bioteknologi 9: 957-962 Christou P (1997) Transformasi padi: pemboman. Tanaman Mol Biol 35: 197-203. Deblaere R, Reynaerts A, Hofte H, Hernalsteens JP, Leemans J, dan Van Montagu M (1987) Vektor untuk kloning pada sel tumbuhan. Meth Enzymol 153: 277-292 Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P. (1994) Keluarga pPZP serbaguna kecil dari vektor biner Agrobacterium untuk transformasi tanaman. Plant Mol Biol 25: 989-994 Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T (1994) Transformasi beras yang efisien (Oryza sativa L.) dimediasi oleh Agrobacterium dan analisis urutan batas-batas T-DNA. Tanaman J 6: 271-282 Hoekema A, Hirsch PR, Hooykaas PJJ, Schilperoort RA (1983) Strategi vektor biner berdasarkan pemisahan daerah vir dan T dari agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Alam 303: 179-180 Hood EE, Helmer GL, Fraley RT, Chilton MD (1986) Hipervirulensi Agrobacterium tumefaciens A281 dikodekan dalam wilayah pTiBo542 di luar T-DNA. J Bac 168: 1291-1301 Hood EE, Gelvin SB, Melchers S, Hoekema A (1993) Plasmid pembantu Agrobacterium baru untuk transfer gen ke tanaman (EHA105). Trans Res 2: 208-218 RA Jefferson, Kavanagh TA, Bevan MW (1987) Fusi GUS: Beta-glukuronidase sebagai fusi gen sensitif dan serbaguna pada tanaman yang lebih tinggi. EMBO J 6: 3901-3907 Klapwijk PM, van Breukelen J, Korevaar K, Oom G, Schilperoort RA (1980) Penentuan resistensi streptomisin Tn904 terhadap plasmid Ti gurita dari Agrobacterium tumefaciens. J Bac 141: 129-136 Lazo GR, Stein PA, Ludwig RA (1991) Transformasi genom ara bidopsis DNA-bukti yang kompeten di Agrobacterium. BioTechnology 9: 963-967 Ohta S, Mita S, Hattori T, Nakamura K (1990) Konstruksi dan ekspresi tembakau dari gen reporter beta-glucuronidase (GUS) yang mengandung intron dalam urutan pengkodean. Plant Cell Physiol 31: 805-814 Oom G, Hooykaas PJJ, Van Veen RJM, Van Beelen P, Regensburg-Tunk JG, Schilperoort RA (1982) Leputasi delta Ti-plasmid Octopine Agrobacterium tumefaciens dengan penekanan pada sisi kanan T -wilayah. Plasmid 7: 15-29 Peralta EG, Hellmiss R, Ream W (1986) Overdrive, peningkat transmisi T-DNA pada plasmid tumor tumor A. tumefaciens. EMBO J 5: 1137-1142 Porath, J. (1992). Kromatografi afinitas ion amobilisasi. Protein Expre Purif 3: 263-281 Siemering KR, Golbik R, Sever R, Haseloff J (1996) Mutasi yang menekan termosensitifitas protein neon hijau. Curr Biol 6: 1653-1663 Tanaka A, Mita S, Ohta S, Kyozuka J, Shimamoto K, Nakamura K (1990) Peningkatan ekspresi gen asing oleh introt dicot dalam beras tetapi tidak pada tembakau berkorelasi dengan peningkatan tingkat mRNA. Dan penyambungan intron yang efisien. Asam Nukle Res 18: 6767-6770 Sumber Lain Jika Anda ingin mendiskusikan atau mengajukan pertanyaan tentang materi CAMBIA silahkan email kami di materialscambia.org Baca Pertanyaan yang Sering Diajukan tentang meminta materi CAMBIA Baca Pertanyaan yang Sering Diajukan mengenai vektor pCAMBIA Informasi GUSPlus di Proyek BioForge GUSPlus. Departemen Patologi Tanaman dan Fisiologi Tanaman, Universitas Negeri Louisiana dan LSU AgCenter, Baton Rouge, AS. Copy hak cipta 2013 Norimoto Murai. Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah Lisensi Atribusi Creative Commons, yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi tidak terbatas dalam media apa pun, asalkan karya aslinya dikutip dengan benar. Diterima 7 Maret. 2013 direvisi 4 April. 2013 diterima 13 April. 2013 Keywords: Agrobacterium tumefaciens Binary Vectors pRK2 pRi pSA pVS1 T-DNA Ti Plasmid Kajian ini mencatat pengembangan vektor biner tanaman dari plasmid Ti di Agrobacterium tumefaciens selama 30 tahun terakhir. Strategi vektor biner dirancang pada tahun 1983 untuk memisahkan daerah T-DNA dalam plasmid kecil dari gen virulensi pada plasmid Ti-Ti-Ti-Ti tanpa rangsang. Vektor tanaman kecil dengan daerah T-DNA sekarang hanya disebut vektor biner Ti. Sebuah vektor biner Ti terdiri dari replika jarak jauh yang luas untuk propagasi pada A. tumeraciens, gen resistensi antibiotik untuk seleksi bakteri dan daerah T-DNA yang akan dipindahkan ke genom tanaman melalui mesin virulensi bakteri. Daerah T-DNA yang dibatasi oleh urutan perbatasan kanan dan kiri mengandung gen resistensi antibiotik untuk pemilihan tanaman, gen reporter, dan juga gen yang diminati. Replika ColEI juga ditambahkan ke tulang punggung plasmid untuk meningkatkan perambatan di Escherichia coli. Tren umum dalam pengembangan vektor biner adalah untuk meningkatkan stabilitas plasmid selama periode kultivasi yang lama dari A. tumefaciens dengan jaringan tanaman inang target. Tren kedua adalah untuk memahami mekanisme molekuler replikasi jarak jauh yang luas, dan menggunakannya untuk mengurangi ukuran plasmid agar mudah dalam kloning dan untuk mendapatkan hasil plasmid yang lebih tinggi pada E. coli. Replika VS1 jarak jauh yang luas ditunjukkan sebagai pilihan replika di atas pRK2, pRi dan pSA karena stabilitas superior dan replika kecil yang didefinisikan dengan baik. Varian biner tanaman yang baru dikembangkan pLSU memiliki tulang punggung plasmid berukuran kecil (4566 bp) yang terdiri dari replika VS1 (2654 bp), replika ColE1 (715 bp), gen bakteri kanamycin bakteri (999 bp) atau tetrasiklin, dan DNA T Wilayah (152 bp). Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri gram-negatif tanah dan patogen tanaman yang menyebabkan penyakit empedu mahkota pada angiosperma dan gymnosperma 1. Interaksi agrobacterium-plant adalah salah satu sistem model pertama dimana mekanisme molekuler patogenisitas tanaman telah dijelaskan secara rinci 2,3. Sekitar 20 kbp segmen DNA (T-DNA) dalam plasmid yang merangsang tumor (sekitar 200 kbp Ti plasmid) dipindahkan dari bakteri ke genom rencana induk oleh mesin molekuler yang mirip dengan transfer bakteri suami-istri 4-6. Fenotip penyakit merupakan manifestasi ekspresi gen T-DNA bakteri pada sel tumbuhan yang merupakan produksi berlebih dari dua hormon pertumbuhan tanaman, sitokinin dan auksin. Sistem transfer DNA alami ini telah dieksploitasi untuk mengenalkan gen agronomi ke tanaman yang menghasilkan produksi tanaman rekayasa genetika oleh perusahaan bioteknologi tanaman. Pendekatan awal transfer gen adalah untuk mengenalkan gen target ke daerah T-DNA plasmid Ti setelah rekombinasi tunggal- (kointegrasi) atau rekombinasi ganda homogen antara vektor perantara (pRK290) dan plasmid Ti 7,8. Strategi vektor tanaman biner dirancang untuk memisahkan daerah T-DNA dalam plasmid kecil dari gen virulensi pada plasmid Ti T-DNA yang tidak genit 9. Vektor tanaman kecil dengan daerah T-DNA sekarang disebut biner Ti Vektor 10,11. 2. Wide Host-Range Origin of Replication dari pRK2 dari IncC-1 Incompatibility Group Hampir semua vektor biner menggunakan asal replikasi pRK2 pada awal penerapannya (Tabel 1). PRK2 adalah plasmid 56 kbp yang besar dari kelompok inkompatibilitas P-1 Tabel 1. Ikhtisar vektor biner bin Ti yang terdaftar berdasarkan reptil jarak jauh yang digunakan untuk propagasi pada Agrobacterium tumefaciens dan juga Escherichia coli. Catatan: 1: Replika ColEI yang berasal dari pBR322 atau pUC18 ditambahkan untuk mempromosikan propagasi vektor biner Ti pada E. coli 2: Mobilisasi (Mob) vektor biner yang dibantu oleh pRK2013 dari E. coli sampai A. kemungkinan adanya tumor (Ya) atau Tidak mungkin (Tidak) dengan kawin triparental 3: Pemilihan bakteri oleh antibiotik: kloramfenikol (chl), kanamisin (kan), gentamycin (gen), spectinomycin (spc), streptomisin (str), atau tetrasiklin (tet). Gen Neomycin PhosphoTransferase (NPTI) memberikan resistensi kanamisin pada bakteri 4: Asal mula urutan batas T-DNA yang berasal dari plasmid tipe nopaline (nop) atau gurita (okt) tipe 2, urutan batas konsensus plasmid nopaline tipe KL (kontra) 5: Gen penanda pilihan tanaman, urutan promotor atau terminator yang berasal dari gen nopaline synthase (nop), gen sintetase gurita (okt), gen manopin sintase (mas), Virus Mosaic Kembang Kolor 35S (35S) atau Morfologi Tumor Besar (tml) T -DNA gen. Bialaphos resistance (BAR) memberikan resistensi herbisida glufosinate. Gentamycin Acetyl Transferase (aacC1) memberikan ketahanan gentamisin pada tanaman. Daerah pengkode Hygromycin PhosphoTransferase (HPT) memberikan resistensi higromisin pada tanaman. Daerah pengkodean Neomycin PhosphoTransferase (NPTII) memberikan resistensi kanamisin pada tanaman. Lokasi gen penanda seleksi tanaman proksimal ke urutan Left Border (LB) atau Right Border sequences (RB) ditunjukkan. Awalnya diisolasi dari aerobes Klebsiella 12. Fitur yang berguna dari replika P-1 adalah rentang host yang luas di antara bakteri Gram-negatif. PRK2 direplikasi dan dipelihara di Esherichia coli, A. tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, Pseudomonas aeruginosa, dan spesies lainnya. Turunan turunan pRK2 yang lebih kecil dihasilkan seperti 20,0 kbp pRK290, 11,0 kbp pTJS133, 10,3 kbp pRK252, dan 7,0 kbp pTJS75 13. Replikasi turunan pRK2 memerlukan 700 bp oriV dan daerah trfA, dan pemeliharaan plasmid yang stabil ini memerlukan daerah tambahan tergantung spesies . Untuk Agrobacterium, pemeliharaan plasmid stabil dalam kondisi non selektif setelah 35 generasi menurun secara progresif dari pRK2 (100) menjadi pTJS133 (96), pRK290 (89), pTJS75 (57) dan pRK252 (12). Turunan pRK2 terkecil pTJS75 memiliki resistensi oriV, trfA, oriT dan tetrasiklin. Turunan turunan pTJS133 yang paling stabil di Agrobacterium dihasilkan oleh penambahan daerah 3,1 kb yang mengandung korA dan korB sampai pTJS75. Sebuah pRK2013 plasmid terpisah berisi gen transfer pRK2, gen mobilisasi sendiri dan replika ColE1, dan digunakan oleh kawakan tri-parental untuk mentransfer plasmid pRK2 dari E. coli ke A. tumefaciens. Dengan demikian, batasan utama plasmid yang diturunkan pRK2 yang akan digunakan untuk vektor biner adalah lokus multi besar yang diperlukan untuk replikasi dan pemeliharaan plasmid (11,0 kbp pTJS133). Keterbatasan lainnya adalah bahwa plasmid turunan pRK2 yang lebih kecil (10,3 kbp pRK252, 7.0 kbp pTJS75 dan 5.0 kbp vektor replika mini-pRK2) dipertahankan kurang stabil di Agrobacterium dalam kondisi tidak selektif 14,15. 2.1. Varian Biner berbasis pRK252 Turunan pRK2 yang lebih kecil 10.3 kbp pRK252 adalah tulang punggung vektor biner pertama pBin19 (11,8 kbp) dengan penambahan gen Streptoccocus faecalis NPTIII untuk ketahanan kanamisin bakteri, batas T-DNA nopaline pTiT37, marker pemilihan tanaman: NPTII: nos, daerah pelengkap -galactosidase (lacZ locus) untuk seleksi, dan situs polylinker dari M13mp19 16. pBI121 (14,7 kbp) dan konstruksi pBI lainnya, dan pBIG pBIB didasarkan pada pBin19 dengan penambahan gen reporter GUS baru 35S: GUS: nos 17,18. PAGS127 (15,0 kbp) memiliki tulang punggung pRK252 dengan daerah T-DNA yang terdiri dari batas kanan kanan gurita dan batas kiri noktif PTiAch5, marka seleksi tanaman: NPTII: ocs, lokus lac Z dan polylinker, dan lokasi cos untuk besar Penyisipan fragmen DNA 19. 2.2. Vektor Biner berbasis pRK290 pRK290 adalah plasmid pRK2 pertama yang dikembangkan yang dikembangkan untuk vektor antar-jemput antara E. coli dan S. meliloti untuk mempelajari lokus genetik untuk nodulasi dan fiksasi nitrogen dari bakteri pengikat nitrogen 12. pRK290 juga digunakan sebagai Vektor menengah untuk mentransfer gen tanaman untuk protein benih benih faseolin ke TDNA dari pTi15955 dan kemudian memperkenalkan gen untuk ekspresi dalam genom bunga matahari dan tembakau 8,20. Sebuah vektor biner pOCA18 (24,3 kbp) memiliki tulang punggung pRK290 dan daerah T-DNA dari batas kanan dan kiri octopine pTi, marka seleksi tanaman: NPTII: ocs, dan situs cos untuk penyisipan perpustakaan DNA Arabidopsis thaliana 21. Demikian pula , PJJ1881 (25,7 kbp) memiliki tulang punggung pRK290 dengan batas kanan kanan ekor kanan dan batas kiri pTiAch5, marka seleksi tanaman: NPTII: ocs gen, polylinker, 35S: GUS atau SPT: nos (SPT, Streptomycin PhosphoTransferase), atau transposon jagung Ac atau Ds 22. Turunan turunan pJJ1881 berbasis pRK290 ditunjukkan untuk mempertahankan fragmen DNA lebih dari 300 kbp pada E. coli 23,24. 2.3. pTJS75-Based Binary Vectors The plasmid pTJS75 was the smallest derivative (7.0 kbp) of pRK2 and used to generate binary vectors pGA471 (15.6 kb) 25,26 and pTRA409 (11.5 kbp) 27. The vector pGA471 has nopaline pTiT37 right and left borders, a plant selection marker gene nos:NPTII:nos, cos site and ColE1 replicon in T-DNA. The vector pTRA409 has the T-DNA with octopine pTi15955 right (with overdrive) and left borders, a plant selection marker gene tml:NPTII:tml and used to test promoter deletion mutants of the bean seed storage protein phaseolin gene. 2.4. mini-pRK2 Replicon-Based Binary Vectors The binary vector pPCV001 (9.2 kbp) has a conditional mini-RK2 replicon (oriV and oriT) and can be maintained in Agrobacterium and E. coli only when co-existed in trans with the trf and tra loci in a helper plasmid pRK2013 or in the E. coli chromosome 14. The T-DNA region of pPCV001 has nopaline pTiC58 right border and octopine pTiB6S3 left border, a plant selection marker gene nos:NPTII:ocs, and pBR322 sequence for plasmid rescue experiments 28,29. The binary vector pCB301 (5.0 kbp) was constructed by PCR cloning of a mini-pRK replicon (oriV and trfA) and bacterial NPTIII kanamycin resistance gene based on DNA sequence of pBin19 15. The T-DNA region consists of nopaline pTiT37 right and left borders, nos:BAR:nos plant selection marker gene (Bar, herbicide glufosinate) and pBlueScriptII polylinker for cloning. 3. Agrobacterium rhizogenes pRi Origin of Replication Agrobacterium rhizogenes is a soil-living plant pathogen causing hairy root disease. A large 200 kbp plasmid pRi has the T-DNA and virulence region and is responsible for causing the disease phenotype. The origin of replication of pRi plasmid locates within the 8.1 kb BanHI-11 fragment and can stably coexist with the pTi origin of replication in A. tumefaciens. The binary vector pC22 (17.5 kb) has the origin of replication of pRiHR1 and ColE1, bacterial resistance gene for ampicilincarbenicillin or streptomycinspectinomycin 30. The T-DNA region of pC22 consists of the right and left borders from octopine pTiB6S3, a plant selection marker gene nos: NPTII:nos, multi-cloning site (BamHI, XbaI) and the cos site for in vitro packaging of Arabidopsis thaliana genomic library. A second binary vector pCGN1547 (14.4 kb) also uses the origin of replication of pRiRH1 and ColE1 and a bacterial resistance gene for gentamycin 31. The T-DNA region of the vector has the right and left borders of octopine pTiA6, a plant selection marker mas:NPTII: mas, the lacZ locus and polylinker site from pUC18 for clonig. The stability of binary vectors in Agrobacterium was compared between plasmids with the origin of replication from pRi and pRK2, pCGN1547 and pBin19, respectively. pCGN1547 was much more stable than pBin19 and after 27 generations in non-selective conditions 54 of Agrobacterium lost the pBin19 while only 1 lost pCGN1547. Thus, the binary vectors containing the pRi origin of replication has the major advantage in stable maintenance, and a limitation in a low copy number of one or few in cells of Agrobacterium. 4. Broad Host-Range Origin of Replication from pSa of IncR Incompatability Group Wide-host-range origin of replication from pSa derived from a cryptic mini-plasmid P15A in E. coli. The replication locus of pSa ori and rep region is one of the smallest known naturally occurring replicons (2.3 kbp). The replication regions were split into two separate plasmids as two-component binary vector systems to reduce the size of T-DNA-containing plasmids 32. pGreen0029 (4.6 kbp) contains a bacterial kanamycin resistance gene, pSa origin of replication, and the TDNA with nopalinepTiT37 right (with overdrive) and left borders, and a plant selection marker nos:NPTII:nos. The suplementary plasmid pSoup (9.3 kbp) has a bacterial tetracycline resistance gene and pSa rep region. pSoup must co-exist in Agrobacterium for replication of pGreen. This two-component binary vector system was used to construct LucTrap vectors to generate transcriptional and translational fusion of the firefly luciferase reporter to randomly targetted genes 33. The stability of binary vectors in Agrobacterium was compared between plasmids with the origin of replication from pSa and pRK2, pGreen000 and pBin19, respectively. pGreen000 was less stable than pBin19 and after one-day in non-selective conditions 50 of Agrobacterium lost the pGreen000 plasmid. Thus, the stable maintenance of pSa-repiconcontaining binary vectors in Agrobacterium is the major limitation for its use when required for a long co-cultivation period of over two days. A new version of the two-component binary vector system, pCLEAN-G and pCLEAN-S corresponds to pGreen and pSoup, respectively 34. A new feature is that both plasmids have the T-DNA region delimited by nopaline pTi consensus right and left borders. The T-DNA of pCLEAN-G115 (6.0 kbp) has a plant selection marker gene 35S:HPT:nos, lacZ selection and polylinker. Supplementary pCLEAN-S166 (11.1 kbp) has a different selection marker nos:HPT:nos in T-DNA (HPT, Hygromycin Phospho Transferase). 5. Broad Host-Range Origin of Replication from pVS1 of IncP Incompatability Group pVS1 is a non-conjugative 29 kbp plasmid of IncP incompatibility group isolated from Psuedomonas aeruginosa. The plasmid was found to replicate in a wide-range of gram-negative bacteria including other Pseudomonas species (P. syringae, P. putida) as well as in A. tumefaciens and S. leguminosarun, but not in E. coli 35. A pVS1 derivative pME290 contains a 3.7 kbp region for replication and stability gene 36. Another pVS1 derivative pGV910 contains an 8 kbp fragment for the stability, replication and mobilization gene 37. The stability of pGV910 in A. tumefaciens GV3101 was compared with that of pRK2 replicon-containing pRK290 37. pGV910 was much more stable than pRK290 and after 15 generations in non-selective conditions only less than 0.5 lost pGV910 while 26 of Agrobacterium lost the pRK290. Plasmid pVS1 was found compatible with IncP-1 and IncP-4 replicons. Coexistence of pGV910 and pRK290 appeared to increase the stability of pRK290 and after 16 generations in nonselective conditions only 12 of Agrobacterium lost pRK290. The origin of replication of pVS1 was defined to a 3.1 kbp fragment for staA, ORF3, repA and oriV by sequence analysis, mutagenesis and maintenance assay in P. fluorescens 38. The coding region of StaA (209 codons) contains two ATP-binding sites and motifs typical of a partitioning protein and is essential for segregational stability. The ORF3 (71 codons) has no apparent similarity with other known proteins but deletion and mutational studies showed the ORF3 is important for segregational stability. The RepA protein with 357 codons shares a strong similarity with other RepA proteins. Mutation from Ala 246 to Val 246 increased the plasmid copy number from 5.9 to 13.8 copies per chromosome, mutation from Asp 260 to Asn 260 reduce the copy number. The oriV locus has the typical sequence organization of origin of replication, a DnaA box, four direct repeats of 21 bp each, an AT-rich region, and a second DnaA box. The backbone of binary Ti vector pPZP plasmid is the 3.8 kb fragment of pVS1 origin of replication and the 1.1 kb ColE1 replicon and bom site from pBR322 39. pPZP111 (11.8 kb) has the T-DNA region consisting of nopaline pTiT37 right and left borders, a plant kanamycin or gentamycin resistance gene 35S:NPTII or aacC1: 35S, respectively, lacZ selection and polylinker from pUC18. pPZP111 has a bacterial chloramphenicol resistance gene from pBR325, and pPZP211 (11.9 kb) has a bacterial streptomycinspectinomycin resistance aadA gene, encoding aminoglycoside-3-adenyltransferase. Presently, a series of pCAMBIA plasmids (9.0 kbp) are among the most widely utilized binary Ti vectors (Genbank accession numbers AF234290-AF234316). The plasmids have the same backbone of pPZP plasmids and their sizes are either 6.2 or 6.4 kb with a bacterial kanamycin or chloramphenicol resistance genes, respectively. The T-DNA region is delimited by the nopaline pTiT37 right (with overdrive) and left border sequences. Two types of plant selection marker are available as either the kanamycin or hygromycin resistance gene, 35S: NPTII or HPT:35S, respectively. Two -glucuronisase reporters are provided, GUS from E. coli (gusA Eco ) or GUSPlus from Staphylococcus sp. (gusA Ssp ). A second reporter green fluorescent protein is also available either as by itself (gfp) or fusion genes with GUS (gusA Eco :gfp or gfp:gusA Eco ). The lacZ selection with multi-cloning sites for insertion was derived from either pUC18, 8 or 9. Modular binary Ti vectors pMODUL and pSAT were developed based on pZP200 (6.7 kbp) as a backbone of the vectors 40,41. The pMODUL vectors took advantage of use of low frequency-occurring enzymes, 13 hexanucleotide and 6 ocatanucleotide restriction sites, and 5 homing endonuclease sites to construct six different expression units in a single construct. Modular pSAT vectors also used 6 octanucleotide restriction endonucleases and Gateway recombination cloning sites for modular assembly of Nand C-terminal fusions to five different autofluorescent tags enhanced green (EGFP), yellow (EYFP) and cyan fluorescent proteins ECFP), red autofluorescent protein (DsRed2), and reduced chloride-ionand pH-sensitivity yellow fluorescent protein (CitrineYFP). Most recently, a series of smaller high-yielding binary Ti vectors pLSU were constructed to increase the cloning efficiency and plasmid yield in E. coli and A. tumefaciens 42-44. The size of the binary vector backbone pLSU1 was reduced to 4566 bp with ColE1 replicon (715 bp) for E. coli and VS1 replicon (2654 bp) for A. tumefaciens, a bacterial kanamycin resistance gene (999 bp), and the T-DNA region (152 bp) ( Figure 1 ). The binary Ti vectors with the truncated VS1 replicon were stably maintained with more than 98 efficiency in A. tumefaciens without antibiotic selection for four days of successive transfers. The transcriptional direction of VS1 replicon can be the same as that of ColE1 replicon (co-directional transcription), or opposite (head-on transcription) as in the case of widely used vectors (pPZP or pCambia). The new pLSU vectors with co-directional transcription yielded in E. coli up to four-fold higher transformation frequency than those with the head-on transcription. In A. tumefaciens the effect of co-directional transcription is still positive in up to 1.8-fold higher transformation frequency than that of head-on transcription. Transformation frequencies of new vectors are over six-fold higher than those of pCambia vector in A. tumefaciens. DNA yields of new vectors were three to five-fold greater than pCambia in E. coli. Figure 2 illustrates the composition of T-DNA in pLSU1 to 5. pLSU1 is a basic backbone vector with the twelve common restriction sites in TDNA. pLSU2 and 3 have the kanamycin resistance NPTII gene as a plant-selectable marker. pLSU4 and 5 contain the hygromycin resistance HPH gene as a plant- Figure 1. Schematic presentation of backbone structure of binary Ti vector pLSU1 (4566 bp). T-DNA is at the top of figure delimited by the right (RB) and left border (LB) with 12 common restriction endonuclease sites, EcoRV (EV), SphI (Sp), HindIII (HIII), NcoI (Nc), XhoI (Xh), KpnI (K), EcoRI (EI), BamHI (BH), PstI (P), ScaI (Sc, XbaI (Xb), and SacI (Sa). The backbone plasmid include the Neomycin PhosphoTransferase I (NPTI), ColE1 origin of replication (ColE1), Stability region A (StaA), Replication region A (RepA), and VS1 origin of replication (VS1). Figure 2. Schematic presentation of the T-DNA region of binary Ti vectors pLSU1 to 5. pLSU1 is a basic backbone vector with the twelve common restriction sites in T-DNA. pLSU2 and 3 have the Neomycin PhosphoTransferase II gene (NPTII) adjacent to the left border as a plant selection marker for kanamycin resistance. pLSU4 and 5 contain the Hygromycin B Phosphotransferasae gene (HPH) adjacent to the left border as a plant selection marker for hygromycin resistance. pLSU3 and 5 also include the -glucuronidase reporter gene (GUS) in addition to the plant selection marker in the T-DNA. selection marker. pLSU3 and 5 also have the GUS reporter gene in addition to the plant-selectable marker. To be compatible with the Gateway Technology (Invitrogene), pLSU vectors were modified to include a bacterial tetracycline-resistance gene 42. The size of the tetracycline resistance gene TetC from pBR322 was reduced to 1468 bp containing 1191 bp of the coding region, 93 bp of 5 upstream, and 184 bp 3-downstream region. The final size of basic binary vector backbone pLSU11 is 5034 bp. pLSU12 and13 have the kanamycin resistance NPTII gene as a plant selection marker. pLSU14 and 15 contain the hygromycin resistance HPH gene as a plant-selectable marker. pLSU13 and 15 also have the -glucuronidase (GUS) reporter gene in addition to the plant selection marker. Constructed also was a mobilizable version of tetracycline-based binary Ti vector pLSU16 in which the mob function of ColE1 replicon was maintained for mobilization of the binary vector from E. coli to A. tumefaciens by tri-parental mating. The final size of binary Ti vector backbone pLSU16 is 5580 bp. The author wishes to acknowledge the financial support partly from the Department of Plant Pathology and Crop Physiology, the College of Agriculture, Louisiana State University, and from the Louisiana Agriculture Experiment Station, LSU AgCenter. E. F. Smith and C. O. Towsend, A Plant Tumor of Bacterial Origin, Science, Vol. 25, No. 643, 1907, pp. 671- 673. doi:10.1126science.25.643.671 I. Zaenen, N. Van Larebeke, H. Teuchy, M. Van Montagu and J. Schell, Supercoiled Circular DNA in Crown-Gall Inducing Agrobacterium Strains, Journal Molecular Biology, Vol. 86, No. 1, 1974, pp. 117-127. doi:10.1016S0022-2836(74)80011-2 M. D. Chilton, M. H. Drummond, D. J. Merlo, D. Sciaky, A. L. Montoya, M. P. Gordon and E. W. Nester, Stable Incorporation of Plasmid DNA into Higher Plant Cells: The Molecular Basis of Crown Gall Tumorigenesis, Cell, Vol. 11, No. 2, 1977, pp. 263-271. doi:10.10160092-8674(77)90043-5 J. R. Zupan and P. Zambryski, Transfer of T-DNA from Agrobacterium to the Plant Cell, Plant Physiology, Vol, 107, No. 4, 1995, pp. 1041-1047. doi:10.1104pp.107.4.1041 J. Sheng and V. Citovsky, Agrobacterium-Plant Cell DNA Transport: Have Virulence Proteins, Will Travel, Plant Cell, Vol. 8, No. 10, 1996, pp. 1699-1710. S. B. Gelvin, Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: The Biology behind the Gene-Jockeying Tool, Microbiology Molecular Biology Reviews, Vol. 67, No. 1, 2003, pp. 16-37. P. Zambryski, H. Joos, C. Genetello, J. Leemans, M. Van Montagu and J. Schell, Ti Plasmid Vector for the Introduction of DNA into Plant Cells without Alteration of Their Normal Regeneration Capacity, EMBO Journal, Vol. 2, No. 12, 1983, pp. 2143-2150. N. Murai, D. W. Sutton, M. G. Murray, J. L. Slightom, D. J. Merlo, N. A. Reichert, C. Sengupta-Gopalan, C. A. Stock, R. F. Baker, J. D. Kemp and T. C. Hall, Phaseolin Gene from Bean Is Expressed after Transfer to Sunflower via Tumor-Inducing Plasmid Vectors, Science, Vol. 222, No. 4623, 1983, pp. 476-482. A. Hoekema, P. R. Hirsch, P. J. J. Hooykas and R. A. Schilperoort, A Binary Plant Vector Strategy Based on Separation of Virand T-Region of the Agrobacterium tumefaciens Ti Plasmid, Nature, Vol. 303, 1983, pp. 179-180. doi:10.1038303179a0 R. Hellens, P. Mullineaux and H. Klee, A Guide to Agrobacterium Binary Ti Vectors, Trends in Plant Science, Vol. 5, No. 10, 2000, pp. 446-448. T. Komori, T. Imayama, N. Kato, Y. Ishida, Y. Ueki and T. Komari, Current Status of Binary Vectors and Superbinary Vectors, Plant Physiology, Vol. 145, No. 4, 2007, pp. 1155-1160. G. Ditta, S. Stanfield, D. Corbin and D. R. Helinski, Broad Host Range DNA Cloning System for GramNegative Bacteria: Construction of a Gene Bank of Rhizobium meliloti, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 77, No. 12, 1980, pp. 7347-7351. doi:10.1073pnas.77.12.7347 T. J. Schmidhauser and D. R. Helinski, Regions of Broad-Host-Range Plasmids RK2 Involved in Replication and Stable Maintenance in Nine Species of Gram-Negative Bacteria, Journal of Bacteriology, Vol. 164, No. 1, 1985, pp. 446-455. C. Koncz and J. Schell, The Promoter of TL-DNA Gene 5 Controls the Tissue-Specific Expression of Chimeric Genes Carried by a Novel Type of Agrobacterium Binary Vector, Molecular General Genetics, Vol. 204, No. 3, 1986, pp. 383-396. doi:10.1007BF00331014 C. Xiang, P. Han, I. Lutziger, K. Wang and D. J. Oliver, A Mini Binary Vector Series for Plant Transformation, Plant Molecular Biology, Vol. 40, No. 4, 1999, pp. 711- 717. doi:10.1023A:1006201910593 M. Bevan, Binary Agrobacterium Vectors for Plant Transformation, Nucleic Acids Research, Vol. 12, No. 22, 1984, pp. 8711-8721. doi:10.1093nar12.22.8711 R. A. Jefferson, Assaying Chimeric Genes in Plants: The GUS Gene Fusion System, Plant Molecular Biology Reporter, Vol. 5, No. 4, 1987, pp. 387-405. doi:10.1007BF02667740 D. Becker, Binary Vectors Which Allow the Exchange of Plant Selectable Markers and Reporter Genes, Nucleic Acid Research, Vol. 18, No. 1, 1990, p. 203. doi:10.1093nar18.1.203 P. Van den Elzen, K. Y. Lee, J. Townsend and J. Bedbrook, Simple Binary Vectors for DNA Transfer to Plant Cells, Plant Molecular Biology, Vol. 5, No. 3, 1985, pp. 149-154. doi:10.1007BF00015678 C. Sengupta-Gopalan, N. A. Reichert, R. F. Baker, T. C. Hall and J. D. Kemp, Developmentally Regulated Expression of the -Phaseolin Gene in Tobacco Seed, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 82, No. 10, 1985, pp. 3320-3324. doi:10.1073pnas.82.10.3320 N. E. Olszewski, F. B. Martin and F. M. Ausubel, Specialized Binary Vector for Plant Transformation Expression of the Arabidopsis thaliana AHAS Gene in Nicotiana tabacum, Nucleic Acids Research, Vol. 16, No. 22, 1988, pp. 10765-10782. doi:10.1093nar16.22.10765 J. D. G. Jones, L. Shlumukov, F. Carland, J. English, S. R. Scofield, G. J. Bishop and K. Harrison, Effective Vectors for Transformation, Expression of Heterologous Genes, and Assaying Transposon Excision in Transgenic Plants, Transgenic Research, Vol. 1, No. 6, 1992, pp. 285-297. doi:10.1007BF02525170 A. F. Bent, B. N. Kunkel, D. Dahlbeck, K. L. Brown, R. Schmidt, J. Giraudat, J. Leung and B. J. Staskawicz, RPS2 of Arabidopsis thaliana: A Leucine-Rich Repeat Class of Plant Disease Resistance Genes, Science, Vol. 265, No. 5180, 1994, pp. 1856-1860. doi:10.1126science.8091210 Q. Tao and H.-B. Zhang, Cloning and Stable Maintenance of DNA Fragments over 300 kb in Escherichia coli with Conventional Plasmid-Base Vectors, Nucleic Acid Research, Vol. 26, No. 21, 1998, pp. 4901-4909. doi:10.1093nar26.21.4901 G. An, B. D. Watson, S. Stachel, M. P. Gordon and E. W. Nester, New Cloning Vehicles for Transformation of Higher Plants, EMBO Journal, Vol. 4, No. 2, 1985, pp. 277-284. G. An, High Efficiency Transformation of Cultured Tobacco Cells, Plant Physiology, Vol. 79, No. 2, 1985, pp. 568-570. doi:10.1104pp.79.2.568 M. D. Burow, P. Sen, C. A. Chlan and N. Murai, Developmental Control of the -Phaseolin Gene Requires Positive, Negative, and Temporal Seed-Specific Transcriptional Regulatory Elements and Negative Element for Stem and Root Expression, Plant Journal, Vol. 2, No. 4, 1992, pp. 537-548. doi:10.1111j.1365-313X.1992.00537.x C. Koncz, N. Martini, R. Mayerhofer, Z. Koncz-Kalma, H. Korber, G. Redei and J. Schell, High-Frequency TDNA-Mediated Gene Tagging in Plants, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, No. 21, 1989, pp. 8467-8471. doi:10.1073pnas.86.21.8467 B. Reiss, C. Koncz, I. Moore and J. Schell, A Family of Binary Gene Vectors with Low Inter-Transformant Variation, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.), Vol. 13, 1994, pp. 143-149. C. Simoens, T. Alliotte, R. Mendel, S. Muller, J. Schiemann, M. van Lijsebettens, J. Schell, M. van Montagu and D. Inze, A Binary Vector for Transferring Genomic Libraries to Plants, Nucleic Acids Research, Vol. 14, No. 20, 1986, pp. 8073-8090. doi:10.1093nar14.20.8073 K. E. McBride and K. D. Summerfelt, Improved Binary Vectors for Agrobacterium-Mediated Plant Transformation, Plant Molecular Biology, Vol. 14, No. 2, 1990, pp. 269-276. doi:10.1007BF00018567 R. P. Hellens, E. Z. Edwards, N. R. Leyland, S. Bean and P. M. Mullineaux, pGreen: A Versatile and Flexible Binary Ti Vectors for Agrobacterium-Mediated Plant Transformation, Plant Molecular Biology, Vol. 42, No. 6, 2000, pp. 819-831. doi:10.1023A:1006496308160 L. I. A. Calderon-Villalobos, C. Kuhnle, H. Li, M. Rosso, B. Weisshaar and C. Schwechheimer, LucTrap Vectors Are Tools to General Luciferase Fusions for the Quantification to Transcript and Protein Abundance in Vivo, Plant Physiology, Vol. 141, No. 1, 2006, pp. 3-14. doi:10.1104pp.106.078097 V. Thole, B. Worland, J. W. Snape and P. Vain, The pCLEAN Dual Binary Vector System for Agrobacterium-Mediated Plant Transformation, Plant Physiology, Vol. 145, No. 4, 2007, pp. 1211-1219. doi:10.1104pp.107.108563 Y. Itoh, J. M. Watson, D. Haas and T. Leisinger, Genetic and Molecular Characterization of the Pseudomonas Plasmid pVS1, Plasmid, Vol. 11, No. 3, 1984, pp. 206-220. doi:10.10160147-619X(84)90027-1 Y. Itoh and D. Haas, Cloning Vectors Derived from the Pseudomonas Plasmid pVS1, Gene, Vol. 36, No. 1-2, 1985, pp. 27-36. doi:10.10160378-1119(85)90066-6 G. Van den Eede, R. Deblaere, K. Goethals, M. Van Montagu and M. Holsters, Broad Host Range and Promoter Selection Vectors for Bacteria That Interact with Plants, Molecular Plant-Microbe Interactions, Vol. 5, No. 3, 1992, pp. 228-234. doi:10.1094MPMI-5-228 S. Heeb, Y. Itoh, T. Nishijyo, U. Schnider, C. Keel, J. Wade, U. Walsh, F. OGara and D. Haas, Small, Stable Shuttle Vectors Based on the Minimal pVS1 Replicon for Use in Gram-Negative, Plant-Associated Bacteria, Molecular Plant-Microbe Interactions, Vol. 13, No. 2, 2000, pp. 232-237. doi:10.1094MPMI.2000.13.2.232 P. Hajdukiewicz, Z. Svab and P. Maliga, The Small, Versatile pPZP Family of Agrobacterium Binary Vectors for Plant Transformation, Plant Molecular Biology, Vol. 25, No. 6, 1994, pp. 989-994. doi:10.1007BF00014672 I. J. W. M. Goderis, M. F. C. De Bolle, I. E. J. A. Francois, P. F. J. Wouters, W. F. Broekaert and B. P. A. Cammue, A Set of Modular Plant Transformation Vectors Allowing Flexible Insertion of up to Six Expression Units, Plant Molecular Biology, Vol. 50, No. 1, 2002, pp. 17-27. doi:10.1023A:1016052416053 T. Tzfira, G. W. Tian, B. Lacroix, S. Vyas, J. Li, Y. Leitner-Dagan, A. Krichevsky, T. Taylor, A. Vainstein and V. Citovsky, pSAT Vectors: A Modular Series of Plasmids for Autofluorescent Protein Tagging and Expression of Multiple Genes in Plants, Plant Molecular Biology, Vol. 57, No. 4, 2005, pp. 503-516. doi:10.1007s11103-005-0340-5 S. Lee, New Binary Ti Vectors with Co-Directional Replicons for Agrobacteium tumefaciens-Mediated Transformation of Higher Plants, Ph.D. Thesis, Louisiana State University, Baton Rouge, 2011. S. Lee, G. Su, E. Lasserre, M. A. Aghazadeh and N. Murai, Smaller High-Yielding Binary Ti Vectors pLSU with Co-Directional Replicons for Agrobacterum tumefaciens-Mediated Transformation of Higher Plants, Plant Science, Vol. 187, 2012, pp. 49-58. G. Su, S. Park, S. Lee and N. Murai, Low Co-Cultivation Temperature at 20730C Resulted in the Reproducible Maximum Increase in Both the Fresh Weight Yield and Stable Expression of GUS Activity after Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation of Tobacco Leaf Disks, American Journal of Plant Sciences, Vol. 3, No. 4, 2012, pp. 537-545. Journal Menu gtgtCurrent Status of Binary Vectors and Superbinary Vectors Note: Always review your references and make any necessary corrections before using. Pay attention to names, capitalization, and dates. Established in 1926, Plant Physiology is an international journal devoted to physiology, biochemistry, cellular and molecular biology, genetics, biophysics, and environmental biology of plants. Plant Physiology is one of the worlds oldest and most well-respected plant science journals. Coverage: 1926-2014 (Vol. 1, No. 1 - Vol. 166, No. 4) The moving wall represents the time period between the last issue available in JSTOR and the most recently published issue of a journal. Moving walls are generally represented in years. In rare instances, a publisher has elected to have a zero moving wall, so their current issues are available in JSTOR shortly after publication. Note: In calculating the moving wall, the current year is not counted. For example, if the current year is 2008 and a journal has a 5 year moving wall, articles from the year 2002 are available. Terms Related to the Moving Wall Fixed walls: Journals with no new volumes being added to the archive. Absorbed: Journals that are combined with another title. Complete: Journals that are no longer published or that have been combined with another title. Subjects: Science Mathematics, Botany Plant Sciences, Biological Sciences Collections: Biological Sciences Collection, Life Sciences Collection, Corporate For-Profit Access Initiative Collection, Ecology Botany II CollectionThe Corsair Binary Options Strategy The 8220Corsair8221 approach to detecting market vector fluctuations is an indicator trading system. the principle of which is built on the use of a combination of precise professional trend indicators. The format of strategy signals allows you to engage in high-frequency intraday trading, the statistics of which show more than 80 of contracts are lucrative. Moreover, the 8220Corsair8221 trading system is straightforward and has universal rules for all trading assets. The Corsair trading system 8211 indicator settings The template markup on the trading chart for the application of the 8220Corsair8221 binary options strategy consists of the following combination of automated analysis tools: The standard RSI indicator The Alligator indicator The RSI 35 indicator, it is necessary to establish the scale level at 50 to determine trend reversals After setting the strategy indicators on the chart, the following system markup should be formed: As a result, we are able, with the help of automatic indicators, to identify on the chart trend changes in market movement, as well as a possible vector for registering binary market contracts. These advanced timing parameters of market analysis lead to the production of accurate and clear trading system signals. It is also worth noting that the 8220Corsair8221 binary options strategy works in its most correct format only when trading on a professional terminal where the following trading and technical tool parameters are available: The set of system technical indicators required to build the template Expiry time periods ranging from 3 to 15 minutes A rather good choice of assets Options yields over 80 Quick position registration The minimum trading conditions from the broker These parameters for correctly using the 8220Corsair8221 binary options strategy are available on a very limited number of trading terminals. The Binomo brokers platform most accurately and optimally meets these requirements. Traders receive the following operating tools and trading conditions on this terminal: A complete set of technical tools that are integrated directly into the terminal Maturity time ranges of contracts from a minute to a day A set of 80 trading assets Contracts with yields of 90 Registration of trading positions in 1.7 ms Trading conditions with these parameters 8211 a trading account from 10 USD, the minimum investment amount is 1 Choosing a broker Parameters for correctly using the Corsair binary options strategy are available on a very limited number of trading terminals. The Binomo brokers platform most accurately and optimally meets these requirements. The Corsair binary options strategy 8211 signals For trading positions with forecast vectors UP, the following indicators of the technical analysis tools must be used: The standard RSI indicator forms a stable growing trend The RSI 35 indicator intersects the scale level of 50 from bottom to top with its moving average On the Alligator indicator, the lines reverse upwards For trading positions with forecast vectors DOWN, the following indicators of the technical analysis tools must be used: The standard RSI indicator forms a stable downward trend The RSI 35 indicator intersects the scale level of 50 from top to bottom with its moving average On the Alligator indicator, the lines reverse upwards We use this format of trading signals for the 8220Corsair8221 binary options strategy for registering contracts on the binary market with maturity periods ranging from 180 seconds to 15 minutes, depending on the current volatility of underlying asset fluctuations. This type of intraday trading allows you to steadily increase your operating capital by 200 on a weekly basis, which shows high statistics for earnings on the binary market. Money management For secure trading on the signals of this trading system, it is necessary to use the classic rules of money and risk management. Moreover, it is necessary to directly take into account the amount of your capital and the optimal ratio between the cost of contracts and the amount of funds in your account. Secure trading is achieved by adhering to the following rules: If the amount of operating capital allows, the maximum level of trading risk for one contract must be limited to 5 of the trading funds in the account For trading on an account with the initial amount of operating capital, only use positions with the minimum cost parameters.
Binary-options-trading-signals-livejournal
4-jam-forex-trading-strategy